甲基化方法诊断3例Prader-Willi综合征摘要目的为临床怀疑Prader-Willi综合征（PWS)的患者建立快速准确的分子诊断方法,使患者能得到确诊，有利于早期治疗。方法小儿内分泌遗传代谢病门诊以肥胖和智力落后就诊的6例患者，根据2001年Meral等提出的临床诊断PWS标准，将3例完全符合临床诊断标准归为高度怀疑组，另3例不完全符合临床诊断标准归为低度怀疑组。用甲基化特异性酶消化患者DNA后，同时扩增15q11.2-13位置SNRPN基因的1号外显子和内参照基因H19。结果3例临床高度怀疑组的患者均确诊为PWS。这3例患者均有典型PWS表现，如新生儿期严重肌张力低下，喂养困难，1岁后肌张力好转，食欲增大，肥胖，轻中度智力落后及特殊面容。另3例低度怀疑的患者有智力落后和肥胖患者，但无新生儿期严重肌张力低下和喂养困难者，排除了PWS诊断。结论该方法结果与临床诊断吻合高。在临床高度怀疑PWS时，建议用甲基化方法快速确诊，以使患儿能得到及时治疗。Prader-Willi综合征（PWS)是第一个被发现基因组印迹缺陷导致的人类疾病。基因组印迹是一种非孟德尔遗传方式,仅存在于哺乳动物,指配子或合子中的某些基因经过表观修饰(epigeneticmodification)后,在后代体细胞不同亲本来源的等位基因差异性表达现象。染色体15q11.2-13位置的小核核糖核蛋白多肽N基因（smallnuclearribonucleoproteinpolypeptideN，SNRPN）是该综合征的一个重要基因，在正常人母源性SNRPN的CpG岛高度甲基化，而父源SNRPN的CpG岛没有甲基化，因此仅来自父亲的基因有表达，而母亲来源的基因失活。该综合征于1887年首次被描述，1980年被发现是由于失去了父源性15q11.2-13位置的印迹基因。男女发病率无明显差异。各种族均有发病，但发病率有一定差异；在美国该病发病率为1／16000～1／25000。国内从1989年即开始陆续有散在病例报道，近几年部分病例经分子生物学方法确诊,如用荧光原位杂交方法检测父源性15q11.2-13片断缺失，用焦亚硫酸钠处理DNA,没有甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶能抵抗修饰，仍为胞嘧啶，然后用甲基化特异性聚合酶链式反应检测15q11.2-13区域的基因甲基化状态[2,3]。本文介绍我们用另外一种快速检测甲基化的方法,确诊3例自2006年11月至2007年7月在上海市儿科医学研究所儿科内分泌遗传代谢病门诊就诊的PWS患儿。1材料和方法1.1研究对象以肥胖，智力落后就诊的6例患儿，根据Gunay-Aygun等2001年提出的PWS临床诊断标准，将完全符合临床诊断标准的3例患者归为高度怀疑组。将不完全符合临床诊断标准的3例患者归为低度怀疑组。高度怀疑组例1，男性，年龄为3岁3个月，身高97.2cm,，体重21.5kg(95%同年龄同性别体重)。因母亲为高龄产妇剖宫产，出生体重正常，出生后严重的肌张力低下，患儿允吸无力，喂养困难，但呼吸正常。2岁会坐，2岁半开步扶走，现能独走，但不稳。1岁开口，现语言发育正常。出生12个月后食欲明显好转，开始体重增加。智测IQ61分，记忆力较好，对痛觉敏感性低，抽血不哭。阴茎极短，仅0.5cm，双睾丸黄豆大小，阴囊发育不良，表现为皮肤皱褶少，肤色浅。2岁9个月时因隐睾作睾丸下降术。无头痛、惊厥、恶心、呕吐等。查肝功能，血脂，血皮质醇，糖基化血红蛋白正常。例2，女性，1例年龄9岁10个月，身高134.1cm,体重49.5kg(95%),因产程延长剖宫产，出生后也有严重的肌张力低下，3月时因少吃少哭在当地医院诊断为“脑瘫”，出生后8个月不会吸奶，2岁半开始独坐，叫人，6岁余开始发胖，现智力落后，数学成绩差。例3，女性,4岁,身高113cm,体重32.5Kg(95%),出生后同样有严重的肌张力低下,喂养困难,1岁后开始肥胖,现智力落后。2例患者查肝功能,血脂,血皮质醇均正常,肝脏B超显示脂肪肝。这3例患者均有典型的PWS面部特征，如长头，窄脸，杏仁眼，小嘴，薄上唇，嘴角向下。低度怀疑组例1为女性，10岁，出生后诊断21三体综合征，新生儿期有轻度肌张力低下，现肥胖，智力落后，1年前出现甲亢。另两例为男性，分别11岁和9岁，同时有轻度智力落后和肥胖，性腺发育正常，无明显新生儿期肌张力低下和喂养困难。1.2研究方法1.2.1外周血白细胞抽提DNA从2ml外周血中用Dextran方法分离白细胞，常规酚氯仿方法抽提DNA。1.2.2酶消化分别在20μl反应体系用10单位McrBC（NewEnglandBiolabs）和10单位HpaⅡ(NewEnglandBiolabs)消化600ngDNA,37℃水浴过夜。1.2.3PCR用PCR方法扩增SNRPN基因外显子1（扩增产物487bp），以H19为内参照基因(扩增产物420bp)。SNRPN基因5’端引物为5’AGGTCATTCCGGTGAGGGAGG3’，3’端引物为5’ACCGCAGACACCCGCAATAGG3’；H19的5’端引物为5’GGCAACATGCGGTCTTCAGAC3’，3’端引物为5’TCCGGAGACAGGGCTGAGCA3’。25μl反应体系包括1μlSNRPN5’端引物（终浓度0.6mmol/L),1μlSNRPN3’端引物（终浓度0.6mmol/L),1μlH19的5’端引物（终浓度0.3mmol/L),1μlH19的3’端引物（终浓度0.3mmol/L)，60ng已被消化的DNA,0.25μlgoTaqpolymerase(Promega),及dNTP(终浓度0.4μmol/L)。94℃变性5min后，以96℃,40s,62℃,1min,72℃,30s循环30圈后72℃延伸7min。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后溴乙锭染色紫外灯下观察。2结果2.1高度怀疑组甲基化检测结果下图显示R131患儿DNA被McrBC消化后，仅内参照基因H19能被扩增，而在同一扩增管内，SNRPN无相应扩增产物，确诊为PWS。其父母SNRPN扩增不受两种限制性酶影响，说明父母均正常。这不同于孟德尔遗传规律中父母为致病基因的携带者。其他2例患儿扩增结果与R131相同（见图1）。2.2低度怀疑组甲基化检测结果该组3例患儿SNRPN扩增不受McrBC消化影响，H19和SNRPN同时被扩增，电泳结果同R131父母（图略），可以排除PWS。3讨论PWS中70％是由于父源性15q11.2-13片断缺失，28％是由于母源单亲二倍性，小于1％的患儿是由于印迹中心突变所致。现有的几种PWS诊断方法中，荧光原位杂交方法对技术及仪器的要求的要求最高，所需时间长，且只能诊断由于基因片段缺失而导致PWS的患者，即70%的患儿。另外母源单亲二倍性和基因印迹中心突变导致PWS的患儿不能经荧光原位杂交方法诊断。本文报告的方法在PCR扩增DNA之前利用两个甲基化特异的核酸内切酶McrBC和HpaⅡ消化DNA模板。McrBC能特异消化甲基化的胞嘧啶，即正常的母源性序列；在PWS患儿，由于缺失了父源性序列，而正常的母源性序列被酶消化，使SNRPN序列不能被扩增。HpaⅡ能消化没有甲基化的CpG序列，即正常的父源性序列；在PWS患儿，由于父源性序列已缺失，HpaⅡ消化对患者DNA无影响，SNRPN序列能被扩增。本方法与焦亚硫酸钠处理后甲基化特异性聚合酶链式反应方法均可以检测99%的患儿，包括由于基因片段缺失和母源单亲二倍性两种原因导致的PWS。该方法简单易行，仪器设备要求低，适用于临床快速诊断。典型PWS表现为孕期胎动减少，新生儿期严重肌张力低下，喂养困难，阴囊发育不良或者隐睾。随后肌张力低下逐渐好转，自1~6岁左右食欲突然增大，不易控制，逐渐发展到肥胖；此期可发现患儿运动智力发育均落后。青春期患儿表现出身材矮小（相对于遗传身高），中枢性性发育低下，可能有行为问题，如脾气暴躁，偷吃，强迫行为等。Gunay-Aygun等报道，97%的PWS患儿有新生儿期肌张力低下和发育落后,93%的患儿有婴儿期喂养困难,1岁后多食,体重暴增和性发育落后。但国内也有报道5例PWS患者均无新生儿期肌张力低下和喂养困难[2，3]。本文报道的3例患儿完全符合临床诊断。在PWS诊断过程中，当患儿1岁以后出现食欲增大，体重暴增时，接诊医生容易怀疑此病。在新生儿和婴儿期，PWS患儿表现为中枢性肌张力低下和喂养困难，需与其他导致松软儿的疾病，如大脑发育不全(软瘫型)，先天性肌病等相鉴别。与先天性肌病相鉴别的是PWS患儿虽然有严重中枢性肌张力低下，但一般呼吸正常，不需要机械呼吸支持。本文前2例患儿在新生儿期被误诊为脑瘫。目前国内报道的PWS患儿多在出现肥胖症状之后。由于甲基化分析方法简单易行，在新生儿期若怀疑此病，可用该方法快速诊断，使患儿得到及时有效治疗。重组人生长激素应用于治疗PWS有10余年，2000年美国食品与药物管理局正式批准应用。数个临床治疗中心的大数量患儿治疗结果显示重组人生长激素提高线性身高增长速度，显著改善患者的最终身高。早期治疗对身高改善效果更好，而且能提高碳水化合物代谢速度，减少脂肪蓄积，促进运动系统和认知发育[9，10]。但在应用重组人生长激素治疗过程中，要密切观察患儿的呼吸系统，嘱家长注意患儿夜间睡眠情况，观察有无打鼾及呼吸暂停，防止呼吸道阻塞窒息而亡，必要时进行扁桃体和增殖腺切除术。基因缺失和母源单亲二倍性导致的PWS再发风险很低，仅为1％，而印迹中心突变导致的PWS再发风险很高，达到50％。为了更好地进行遗传咨询和产前诊断，本文3例患者还需进一步分析疾病分子机制。
